Várečné kvasnice III.

KVASNIČNÝ CYKLUS A STÁRNUTÍ KVASNIC

Kvasničný cyklus se obvykle definuje jako údobí mezi dvěma následnými děleními a zahrnuje několik typických fází. Individuální fáze buněčného cyklu se týkají vždy jednotlivé buňky a tím odlišují od známých růstových fází buněčné populace, zahrnující počáteční lag fázi, fázi exponenciálního růstu a posléze opět stacionární fázi růstu. Buněčný cyklus kvasinek zahrnuje presyntetickou fázi G1, S - fázi syntézy DNA, postsyntetickou fázi G2 (dorůstání pupenu) a mitotickou fázi M.

Jednotlivé kvasničné buňky podléhají stejně jako ostatní organismy individuálnímu stárnutí, určený omezeným počtem dělení buňky (tzv. Hayflickův limit). U kvasinek lze v průběhu stárnutí zaznamenat morfologické i fyziologické změny, např. zvětšování buněk, vrásnění buněčné stěny, rostoucí počet jizev po nově zrozených buňkách, zvýšení generační doby apod. Stárnutím také kvasničné buňky ztrácejí kvasivou schopnost, což se makroskopicky projeví ve složení kvasničného sedimentu v konusech kvasných nádob (tzv. gradient věku). Nejdříve se usazují velké staré buňky s nízkou technologickou aktivitou a nejpozději malé mladé buňky opět s nižší aktivitou, což se dobře shoduje s osvědčenou praxí oddělování středního jádra várečných kvasnic.

ZÍSKÁVÁNÍ KVASNIC

Kvasnice se získávají pěstováním v propagačních stanicích, nebo nákupem z jiných pivovarů. Jedno až dvounádobové propagační stanice napodobují klasický způsob kvašení nejčastěji s převáděním kultury ve stadiu kroužků. V zahraničí, zejména v Německu se kvasnice často pěstují za současného občasného vzdušnění (tzv. asimilační pomnožování kvasnic), což zvyšuje produktivitu i aktivitu kvasnic, ale vyžaduje dokonalejší regulaci procesu.

Čisté kultury kvasinek se mohou získat ze sbírek kvasinek. Informace o sbírkách pivovarských kvasinek lze získat na serverech www.natur.cuni.cz/fccm a www.professionalbrewer.com/yeast.htm . Zejména druhý odkaz nabízí možnost hledat vhodný kmen kvasnic podle předem stanovených technologických požadavků. Kvasnice se dodávají jako čisté kultury, sušené kvasnice, nebo v suspensi mladinou. Této nabídky využívají zejména malé pivovary.

MĚŘENÍ AKTIVITY KVASNIC

1. Požadavky na aktivitu várečných kvasnic

V souboru vlivů, které působí na kvasný proces hraje aktivita kvasnic důležitou roli. Při konstantní zákvasné dávce se technolog snaží dodržovat stálé podmínky procesu, jako jsou zákvasná teplota, množství rozpuštěného kyslíku, minimální kontaminace mladiny a její složení. Průběh kvašení se reguluje chlazením kvasné nádoby, což při nízké aktivitě kvasnic nebo nevhodném složení ovšem poskytuje jen omezené možnosti. Doba hlavního kvašení, stupeň prokvašení a teplota při sudování jsou hlavní souhrnné ukazatele vyrovnanosti kvašení a jejich kolísání vždy svědčí o nezvládnutém průběhu kvašení a zásadních chybách v nastavení hlavních parametrů kvašení. Rychlý a vyrovnaný průběh změn extraktu zaručuje rychlé odbourávání diacetylu a sensorickou stabilitu. V literatuře se metody měření aktivity zpravidla dělí na měření viability a vitality. Hranice mezi oběma skupinami metod není ostrá, protože např. barvicí metody, používané pro hodnocení vitality se spojují často i s aktivitou kvasničných enzymů a naopak buňky, neschopné reprodukce mohou vykazovat kvasnou aktivitu.

2. Reprodukční schopnost kvasnic

Existují dvě modifikace této metody, klasická plotnová metoda a mikroskopická metoda s pozorováním tvorby mikrokolonií. Pro příliš dlouhou dobu stanovení se v kontrolní praxi tyto metody používají jen zřídka.

3. Barvení buněk s pozorováním ve viditelné oblasti

Přes častou kritiku klasické barvicí metody s methylenovou modří patří tato metoda mezi všeobecně používané oblíbené postupy. Existují četné varianty metody slibující lepší reprodukovatelnost, přesnější výsledky, nebo dokonalejší rozlišení aktivních i inaktivních buněk, čehož se zpravidla dosahuje přídavkem dalších látek, barviv, nebo podmínek barvení. Novou variantu představuje náhrada methylenové modři methylenovou violetí. Z ostatních metod se uvádí barvení s Ponceau červení, barvení methylenovou modří se safraninem O, nebo s basickým fuchsinem.

4. Fluorescenční barvení

Fluorescenční barvení využívá enzymové aktivity kvasnic k rozštěpení barviva, čímž se uvolní složka, fluoreskující ve světle s vhodnou vlnovou délkou (většinou v UV oblasti), nebo vazby fluorescenčního barviva na buněčné struktury, o čemž opět často rozhoduje prostupnost buněčné stěny. Do první skupiny patří barviva jako diacetát . fluoresceinu a karboxyfluoresceinu, , druhou skupinu zastupují barviva jako anilinová modř, akridinová oranž, bromkresolový purpur, nebo zeleň, calcofluor, Fungolight (TM) , oxonol, primulin, propidium jodid, isothiokyanát flouresceinu hořečnatá sůl kyseliny 1-anilin-8-naftalensulfonové, rhodamin B, rhodamin 123, erthrosin B, eosin Y a viablue.

Tyto techniky vyžadují drahý fluorescenční mikroskop. Ještě dražší je automatický průtokový cytometr, umožňující měřit rozdělení buněk podle zbarvení jejich jednotlivých částí a rozptylu světla v různých úhlech..

5. Měření aktivity kvasničných enzymů

Kromě aktivity esteras v mikroskopickém (odst.8.4) i makroskopickém provedení se měří aktivity proteas, jejichž vysoké hodnoty svědčí o počínající autolýze kvasnic. Důležité je měření redukční aktivity kvasnic na základě měření schopnosti redukovat diacetyl, furfural, nebo tetrazoliové soli (TTC - Trifenyl Tetrazolium Chlorid). S aktivitou kvasničných enzymů také souvisí vylučování hořečnatých iontů z buňky (MRT - Magnesium Ion Release Test)

6. Měření obsahu charakteristických sloučenin

V kvasnicích se obvykle stanovuje obsah glykogenu nebo trehalosy, přičemž se používají enzymové testy, infračervená spektroskopie, nebo selektivní barvení s číslicovým zpracováním obrazu. Dále se různými analytickými metodami hodnotí obsah lipidů, sterolů a nenasycených mastných kyselin. Relativně snadné měření obsahu ATP bioluminiscenčními metodami umožňuje usuzovat na aktivitu kvasnic, podobně jako při fluorimetrickém měření obsahu NADH, popř. poměru NAD/NADH.

7. Měření hodnot pH vně i uvnitř buněk

Měření změn pH vnějšího prostředí po přídavku kvasnic do roztoku zkvasitelných cukrů jako míru aktivity kvasnic navrhli původně čeští autoři Opekarova a Sigler. Prosté měření pH v husté suspensi sebraných kvasnic vypovídá o vhodnosti kvasnic pro opětovné nasazení. Intracelulární pH (ICP) je měřením aktivity vylučování vodíkových iontů z buňky (tzv. H+ pumpa). Test využívá fluorescenčního barviva esterifikovaného 5 nebo 6 karboxyfluoresceinu a vztahu mezi vnitřní hodnotou pH a fluorescencí barviva. Cytoplasmatické pH se také může měřit podle obsahu 31P metodou NMR.

8. Měření fyziologických procesů kvasnic

Mezi nejčastěji používané metody patří měření spotřeby rozpuštěného kyslíku v nejrůznějších modifikacích, měření vývinu oxidu uhličitého za konstantního tlaku nebo objemu, podle změn hmotnosti, nebo hodnot derivace těchto veličin. Rychlý start kvašení lze stanovit deflokulačním testem. Nejpřesnější, ale také nejzdlouhavější metody se zakládají na modelování hlavního kvašení a sledování průběhu kvasné, růstové a sedimentační křivky kvasnic v otevřených, nebo uzavřených kvasných válcích.

RYCHLÉ STANOVENÍ KONCENTRACE KVASNIC

Hustota kvasničných buněk se pohybuje mezi 1,07 - 1,09 g.cm-3. Pro stanovení objemového podílu buněk se suspense kvasnic se vpraví do centrifugační kyvety s rovným dnem (průměr 1 cm) a odstřeďuje 10 min při 3000 ot.min-1. Podíl výšky sedimentu ode dna z celkové výšky tekutiny je objemový podíl kvasnic a vyjadřuje se v procentech. Odhad obsahu sušiny kvasničné suspense se získá dělením objemového podílu kvasnic číslem 4.

1g kvasničné suspense o koncentraci 10 % sušiny obsahuje asi 109 buněk. Při spektrofotometrickém stanovení kvasinek v mladině se k k 4 ml zakvašené mladiny ve válcovité skleněné kyvetě (průměr 1 cm) přidá 0,4 ml roztoku NaOH (c = 20 %), uzavře zátkou a po promíchání změří absorbance při 800 nm proti destilované vodě. Pro hodnotu absorbance mezi 0,2 - 1,0 platí, že počet milionů buněk v 1 ml mladiny se rovná 50*A800.

LITERATURA
HEGGART, H.M., et al. Techn. Quart. MBAA, 36, 1999, s.383.
HEGGART, H.M., et al.:Techn. Quart. MBAA, 37, 2000, s.409.
ŠAVEL, J.: Kvasny prum. 45, 1995, s.258.
BENDOVÁ, V. et al.: Pivovarské kvasinky. SNTL, 1.vyd. Praha 1981.

Článek byl původně napsán pro Pivovarnický kalendář - ročník 2001.